Identification and Bioinformatics Analysis on Phosphatidylcholine Diglyceride Choline Phosphotransferase Family Genes in Plants

Ran Xiaoru　Hong Jun　Yan Fazhe　Shi Jianxin ^*

Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240

* Corresponding author, jianxin.shi@sjtu.edu.cn

Abstract　Phosphatidylcholine diglyceride choline phosphotransferase (PDCT) is involved in the synthesis of seed triglyceride (TAG) in plant, catalyzing the transfer between phosphatidylcholine (PC) and diacylglycerol (DAG), and the loss of the PDCT activity reduces significantly the accumulation of seed polyunsaturated fatty acids (PUFAs). In this study, taking advantage of public available genomes of six oil crops (peanut, rape, soybean, cotton, sesame and sunflower), two staple food crops (rice and maize) and one aquatic plant (Chinese lotus), we identified in total 20 PDCT orthologues using bioinformatics, and further investigated into physical and protein chemical property, chromosome distribution, phylogenetic evolution, gene structure and promoter sequence. Our results showed that the PDCT family members have conserved domains and gene structures, as well as stable protein properties and structures, implying certain evolutionary conservation among them. In addition, copy numbers of PDCT were significantly different in tested plant species, while crop plants and Arabidopsis had one single copy, oil crops almost have at least 2 copies. Furthermore, the existence of many transcription core promoter elements and photo-response cis-acting elements in the promoter regions of these identified PDCT genes indicated that the expression of PDCT genes is likely affected by multiple developmental and environmental stress signals. In sum, this study provided a bioinformatics reference for further study on the potential application of PDCT family genes in crop breeding.

Keywords　PDCT, Protein structure, Evolutionary analysis, Promoter analysis

植物种子油在人类的日常生活中扮演着重要的角色；它不仅是重要的膳食脂肪来源，也是生物燃料及其他工业应用的重要来源(Cahoon et al., 2007; Lu et al., 2011)。不同植物种子油的功能、性质及对特定应用的适用性主要取决于其脂肪酸的组分和含量(Wickramarathna et al., 2015)。根据双键个数，植物种子油中不饱和脂肪酸可分为单不饱和油酸(oleic acid, 18:1; OA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)两种。研究表明，增加植物种子油中OA (18:1)的比例能够改善氧化稳定性，对人体有显著的健康效益，对生物柴油及其它可再生资源的生产也十分重要(Kinney, 1996)。与此同时，高PUFA也是人类饮食计划中可行的营养选择(Hunter, 1990; Williams and Burdge, 2006)。基于此，作为饮食中必需脂肪酸的主要来源，植物体内三酰甘油的合成及相关酶学的研究一直是科学家们较为关注的领域。

在油料作物种子发育过程中，质体内形成的单不饱和油酸(18:1)大部分进入磷脂酰胆碱(PC)中(Shanklin and Cahoon, 1998, Bates et al., 2007)，之后经过脂肪酶去饱和酶2 (fatty acid desaturase 2, FAD2)与FAD3的去饱和作用，形成亚油酸(18: 2)与亚麻酸(18: 3) (Browse et al., 1993, Wallis et al., 2002)，此后PC被并入TAG中，成为许多植物种子内贮藏脂肪的常见形式，也是人类膳食营养选择中必需脂肪酸的主要来源(Lu et al., 2009)。

之前的研究发现了植物种子油脂形成中的一个关键酶，即磷脂酰胆碱甘油二酯胆碱磷酸转移酶(PDCT)，它在种子TAG合成过程中可以催化胆碱磷酸头部的交换，进而实现PC和DAG的相互转化(Lu, Xin et al. 2009)。PDCT作为一种把关酶，提供了18:1进入PC去饱和成为18:2和18:3的重要途径，以及18:2和18:3的去饱和产物返回DAG的重要途径。拟南芥(Arabidopsis thaliana)中研究发现，PDCT的缺陷减少了种子中40%的多聚不饱和脂肪酸(PUFA)含量(Lu, Xin et al. 2009)，油菜(Brassica napus)中的实验也证明了PDCT活性的丧失对降低油菜籽油PUFA积累量的效果，此外，在酵母和拟南芥中异源表达亚麻(Linum usitatissimum L.)的PDCT基因增加了突变体PUFA水平(Wickramarathna et al., 2015)，以上研究结果表明，PDCT在植物种子PUFA积累中的重要作用。不过，PDCT在其它物种中的研究很少，除了上述提到的参与种子PUFA积累的作用外，它们是否会有其它方面的功能。本研究通过生物信息学的手段，利用已公布的六种油料作物花生(Arachis hypogea)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、芝麻(Sesamum indicum)、向日葵(Helianthus annuus)，和两种粮食作物水稻(Oryza sativa Japonica Group)、玉米(Zea mays)，以及一种水生植物中国莲(Nelumbo nucifera)的基因组信息，鉴定出20个编码PDCT的同源基因，此后对它们的蛋白理化性质、基因结构与进化关系、启动子元件等进行了汇总分析。本研究的结果为进一步探讨该家族基因的育种应用提供了生物信息学参考。

1结果与分析

1.1 PDCT家族的鉴定

我们以拟南芥中报道的PDCT (AtROD1)的蛋白序列为query,利用blast程序分别在大豆、甘蓝型油菜、向日葵、陆地棉、花生、芝麻、水稻、玉米和中国莲的蛋白数据中进行检索，汇总整理后共获得了31个初始候选成员，之后利用保守结构域分析，去除冗余，最终得到20个候选PDCT家族。NCBI数据库显示，20个基因均隶属于PAP2_Like Superfamily，这段与在蓖麻中发现的PDCT的基因一致。此外甘蓝型油菜鉴定出的4个PDCT同源基因与已报道的鉴定结果一致，这进一步证实了我们结果的可靠性。根据在染色体上的位置，我们对20个PDCT同源基因按“物种+PDCT+数字”的形式依次命名。PDCT基因家族核苷酸序列差异较大，较短的是中国莲NnPDCT1 (1 630 bp)和NnPDCT2 (1 391 bp)，最长的是油菜中的BnPDCT4 (8 875 bp)(表1)。

表1 9个植物中PDCT基因家族成员基本信息 Table 1 Basic information of PDCT gene family members in tested 9 plant species

1.2 PDCT家族蛋白基本理化特性分析

我们接着对20个PDCT家族蛋白基本理化特性进行了表征(表2)。尽管测试的九个物种中PDCT基因的长度差异较大，其编码的蛋白序列均在224 aa ~307 aa之间。对它们的理化性质分析发现，九个物种20个PDCT蛋白家族成员的分子量在25.13~33.20 kDa之间，带正电荷氨基酸均多于带负电荷氨基酸，理论等电点均大于7，呈碱性，范围在8.15~10.06之间，说明PDCT家族蛋白富含碱性氨基酸。ProtScale对蛋白的分析结果显示，九个物种的PDCT蛋白的脂溶指数均超过了80，大小在89.19~107.01之间，表现出较高的脂溶性。疏水指数均大于0，表明PDCT家族蛋白均表现为疏水性。不稳定系数的数值以40为界,小于40蛋白表现为稳定性,大于则表示为不稳定。据此，我们可知在九个物种中，8个PDCT家族蛋白表现为具有不稳定性，剩余12个蛋白表现得较为稳定。

表2 PDCT蛋白的基本理化特性 Table 2 Basic physiological and chemical features of PDCT proteins identified

1.3 PDCT家族蛋白结构及磷酸化位点分析

我们同时也对20个PDCT家族蛋白结构及磷酸化位点进行了分析(表3)。PDCT蛋白质二级结构预测结果显示它们在组成上具有相似的特征：α螺旋和随机卷曲两种结构占比较大，分别为32.86%~52.3%和33.48~48.41%。跨膜区域分析结果显示在所有的双子叶植物中，PDCT蛋白均存在4个跨膜螺旋结构，在单子叶植物水稻和玉米中，PDCT蛋白的跨膜结构显示为3个。磷酸化位点分析显示PDCT家族蛋白磷酸化位点均较少，在13-31之间，且多集中在丝氨酸(Serine, Ser)和苏氨酸(Threonine, Thr),而酪氨酸(Tyrosine, Tyr)磷酸化位点较少(表3)。此外，对20个PDCT家族蛋白的信号肽分析均未检测到信号肽，显示PDCT蛋白很可能为非分泌蛋白。

表3 PDCT蛋白结构与磷酸化位点 Table 3 Phosphorylation sites and structures of PDCT proteins

1.4 PDCT家族蛋白序列功能域分析

我们又对20个PDCT家族蛋白的功能域进行了预测，结果发现PDCT蛋白序列中具有15个相似度较高的保守基序(图1A)。在这15个保守基序中，基序1-6分布基本一致，表现出高度保守。总体来说，尽管物种差异较大，保守基序间差异较小，数量均在7~10之间(图1B)。对保守基序进行SMART在线检测，发现motif1为SOCS_box结构域，motif2为PAP2_3结构域。

图1 PDCT家族蛋白保守基序预测 注: A: 保守性较高的PDCT基因家族基序结构; B: 基序的分布及序列 Figure 1 Prediction of conserved motifs in PDCT family proteins Note: A: Highly conserved motif patterns of PDCT gene families; B: The distribution and sequence of motifs

1.5 PDCT基因在九个物种中的染色体定位

根据PDCT在九个物种内的基因组序列信息，我们还对其在染色体上的分布进行了绘制(图2)。鉴定到的PDCT基因数目较少，在各物种染色体上呈现较为均匀的分布。在花生中，AhPDCT基因分别分布在2号(Chrome02)、9号(Chrome09)和19号(Chrome19)染色体上；在甘蓝型油菜中，BnPDCT1和BnPDCT2定位在A基因组上，其中BnPDCT1位于3号染色体(ChromeA3)，BnPDCT2位于5号染色体(ChromeA5)；BnPDCT3和BnPDCT4均定位在C基因组的5号染色体上(ChromeC5)，更多分布请见图2。

图2 PDCT家族基因的染色体定位 A: 花生; B: 甘蓝型油菜; C: 大豆; D: 陆地棉; E: 向日葵; F: 芝麻; G: 中国莲; H: 水稻; I: 玉米 Figure 2 Chromosomal distribution of PDCT genes. Note: A: Arachis hypogaea；B: Brassica napus; C: Glycine max; D: Gossypium hirsutum; E: Helianthus annuus; F: Sesamum indicum; G: Nelumbo nucifera; H: Oryza sativa Japonica Group; I: Zea mays

1.6 PDCT基因家族在九个物种中的进化关系及基因结构分析

为了探寻PDCT基因家族的进化，我们根据本研究鉴定的九个物种及先前报道的拟南芥、亚麻和蓖麻中的PDCT蛋白序列构建进化关系树，结果显示，同一物种的PDCT基因在进化距离上较为接近。进一步分析结果显示，花生中AhPDCT2和AhPDCT3两个亚型相对AtPDCT1来说进化距离较近，陆地棉中GhPDCT1和GhPDCT2，GhPDCT3和GhPDCT4分别进化距离最近，油菜中BnPDCT1和BnPDCT4，BnPDCT2和BnPDCT3分别进化距离最近。此外，进化关系中还显示，相对其他双子叶植物，芝麻和向日葵与单子叶的水稻和玉米在进化距离上较近些(图3)。

图3 PDCT基因家族系统发育分析 注: 花生: 黄绿色圆点; 甘蓝型油菜: 深青色圆点; 大豆: 灰色圆点; 陆地棉: 棕色圆点; 向日葵: 浅青色圆点; 芝麻: 粉色圆点; 蓖麻: 深蓝色圆点; 拟南芥: 浅蓝色圆点; 亚麻: 橘色圆点; 中国莲: 紫色方块; 水稻: 棕色三角; 玉米: 橘色三角 Figure 3 Phylogenetic analysis of PDCT genes Arachis hypogaea: Kelly dots; Brassica napus: Dark cyan dots; Glycine max: Grey dots; Gossypium hirsutum: Brown dots; Helianthus annuus: Light cyan dots; Sesamum indicum: Pink dots; Ricinus communis: Dark blue dots; Arabidopsis thaliana: Light blue dot; Linum usitatissimum: Orange dots; Nelumbo nucifera: Purple square; Oryza sativa Japonica Group: Brown triangle; Zea mays: Orange triangle

为了更深入的了解PDCT基因家族的进化关系，我们对本研究鉴定出的20个PDCT基因的结构进行了分析。结果显示，同一植物的基因结构在组成上具有更高的相似性，这与进化分析的结果一致。油菜、花生等双子叶陆生植物的PDCT基因大部分含有3个外显子和2个内含子，而单子叶植物水稻和玉米以及水生植物莲含有2个外显子及1个内含子。九个物种PDCT基因的内含子相位均为0，显示了其高度的保守性(图4)。

图4 PDCT基因结构分析 注: 绿色条形代表编码区, 紫色条形代表非翻译区, 横线代表内含子, 数字(0, 1, 2)则表示为内含子的相位 Figure 4 Gene structures of PDCT family members. Note: The green and purple bar represent the CDS and the un-translated region (UTR), respectively, while the black line represents the intron; Numbers (0, 1, 2) stand for the intron phase

1.7 PDCT基因启动子顺式作用元件分析

最后，我们对20个PDCT基因的启动子序列进行在线分析，以寻求可能存在的顺式作用元件。结果显示，除去未知功能的元件，20个基因的启动子共包括2 836个顺式作用元件。其中，作为转录核心启动子元件的TATA-box (974个)和CAAT-box (720个)所占比例最大，胁迫响应元件MYB (112个)和MYC (73个)次之。此外，我们还发现了206个与光响应相关的顺式作用元件，包括G-box，Box 4，GT1-motif等14个种类，分布在所有鉴定的PDCT基因中。每个基因光响应相关的元件数量为4~9个，其中AhPDCT1中的数量最多(图5)。

图5 PDCT基因启动子顺式作用元件结构 Figure 5 Cis-acting elements structures in the promoter region of PDCT family members

2讨论

不饱和脂肪酸特别是PUFA在人类健康膳食中起着重要的作用，因此，在作物育种上，控制不饱和脂肪酸的合成来提升食用油品质已经成为未来油料作物的改良新方向。PDCT已经被证明是植物种子在TAG积累过程中合成PUFA的关键酶，比如拟南芥种子中PDCT的缺陷导致突变体种子中PUFA的含量减少了40% (Lu et al., 2009)，而亚麻和油菜研究也证实了PDCT对油料植物种子不饱和脂肪酸合成的重要作用(Wickramarathna et al., 2015)。目前，PDCT基因鉴定及初步功能研究仅局限于少数几个模型植物，PDCT在其它植物中的存在及功能尚未得到解析。因此，植物中特别是油料作物中PDCT的鉴定及功能研究还需要进一步的加强。近年来，不断完善的物种基因组信息为全基因组范围内鉴定并分析各种基因家族包括PDCT家族提供了可能。本研究利用生物信息学的手段，在9种不同的植物包括花生、油菜、大豆、棉花、芝麻、向日葵、莲、水稻和玉米中共鉴定得到了20个PDCT基因，油菜中鉴定得到的4个PDCT基因与已发表的结果一致。研究结果为进一步研究PDCT家族基因功能和可能的育种应用提供了重要的生物信息数据。

我们的结果表明，PDCT家族成员在进化中存在着一定的保守性，主要表现为：(1) PDCT蛋白性质与结构的稳定：鉴定得到的20个蛋白不仅在氨基酸数目上较为接近，在分子量上也均为30 kDa左右，均呈现碱性，正电荷残基数多于负电荷残基数，并均表现为疏水性蛋白。此外，在二级结构组成比例上，PDCT家族蛋白相近，均是α螺旋和无规则卷曲占据大部分，在磷酸化位点的分析上也均表现为苏氨酸和丝氨酸主导。(2)基因结构的保守：尽管序列长度上差异较大，PDCT家族基因在结构上较为相似，双子叶陆生植物均含有3个外显子和2个内含子，而水生植物莲及单子叶植物水稻和玉米则表现为2个外显子和1和内含子，且内含子相位高度保守，均为0。(3)进化距离的保守：进化关系发生树结果与PDCT家族蛋白的种内关系一致。(4)结构域的保守：无论是单双子叶植物还是水生陆生植物，均存在PAP2_3结构域，并位于蛋白靠近C端的位置。

我们的结果也表明，PDCT家族基因拷贝数在受测的九个植物中存在明显差异，但均在4个以内。粮食作物(水稻和玉米)及模式植物(拟南芥)中的PDCT是单拷贝的，而油料作物(花生, 油菜, 大豆, 棉花和向日葵)中的PDCT是多拷贝的(2个或以上)。有趣的是，油料作物芝麻中的PDCT却是单拷贝，但这个结果还值得进一步明确。本研究发现的PDCT基因拷贝数的结果与之前在拟南芥(Lu, Xin et al. 2009)、亚麻(Wickramarathna, Siloto et al. 2015)和油菜中的报道一致。

进化树分析结果显示，这些单拷贝的物种进化上相对比较近，且芝麻的PDCT和其它典型油料作物蓖麻、亚麻、花生和大豆的PDCT相对较远。这个结果一方面暗示PDCT可能在油料植物和粮食作物进化或分化中起着一定的作用，另一方面也暗示粮食作物中的PDCT可能具有和油料作物中的PDCT不同的酶活或功能。有意思的是，比较唯一水生作物中国莲的PDCT与其它陆生作物的PDCT进化距离后发现，PDCT也很可能与陆生和水生植物的分化有一定的关联。这些信息为后续研究PDCT基因功能及进化提供了有价值的参考。

我们的结果还表明，PDCT家族基因的启动子中存在大量的胁迫响应元件及光响应元件，暗示PDCT的表达很可能受到很多生长和环境胁迫信号特别是光反应信号的影响。因此有理由相信PDCT在植物的生长和环境胁迫特别是光反应中也可能起着重要的作用。

3材料与方法

3.1数据下载与鉴定

本研究从NCBI (National Center of Biotechnology Information)数据库(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/)，分别下载了花生(Arachis hypogea, V3)、甘蓝型油菜(Brassica napus, V2)、大豆(Glycine max, V2.1)、陆地棉(Gossypium hirsutum, V1)、向日葵(Helianthus annuus, V1)、芝麻(Sesamum indicum, V1)、中国莲(Nelumbo nucifera, V1.1)、水稻(Oryza sativa Japonica Group, V4)和玉米(Zea mays, V4)的蛋白组序列、基因组序列及基因注释文件。

以文献中报道的拟南芥PDCT (AtROD1)蛋白序列为query，使用Blast 2.5.0软件(Camacho, Coulouris et al. 2009)检索九个物种的PDCT基因同源蛋白(E-value=1e^-10)。对筛选结果人工去重复后，得到PDCT家族初始蛋白，之后将初始蛋白序列上传至CDD在线网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行初步功能结构域检测分析，经人工去冗余后，得到PDCT家族候选成员，用于后续分析。

3.2 PDCT家族蛋白分析

对上述步骤得到的候选蛋白进行分析,使用在线网站ExPASy中的Compute pI/MW (https://web.expasy.org/compute_pi/)对得到的20个PDCT家族蛋白进行分子量及理论等电点的预测；在线软件ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)对电荷残基数、总原子数、不稳定系数、脂溶指数和疏水指数等一级理化性质进行预测；选择PHD (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/ NPSA/npsa_phd.hml)的方式对PDCT家族的蛋白质二级结构进行预测；SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)实现对蛋白质信号肽的检测；TMHMM网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/)实现跨膜结构的分析；NetPhos 3.1 Server (www.cbs.dtu.dk/ services/NetPhos/)在线网站实现磷酸化位点的检测；最后利用MEME (http://meme-suite.org/)在线软件对九个物种的PDCT蛋白序列进行了保守基序(motif)的预测和分析。

3.3 PDCT基因结构、染色体定位、进化关系及启动子分析

九个物种中PDCT基因的位置信息通过TBtools软件实现了其在染色体上的分布绘制。MEGA-X软件(Kumar et al., 2018)则实现了系统发生关系树的构建：PDCT蛋白序列经ClustalW实现多序列比对(Gap Opening Penalty=10, Gap Extension Penalty=0.2, Delay Divergent Cutoff=30%)后，采用最大似然法(Bootstrap=1000, Partial deletion)得到进化树。

利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线软件实现了对PDCT基因结构的绘制；PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/)实现了启动子顺式作用元件的分析，并利用TBtools软件进行了结构图的绘制。

作者贡献

冉晓茹是实验研究执行人和论文草稿写作人；洪骏和晏法哲参与数据整理、结果讨论和论文草稿写作；石建新是项目负责人、本研究的实验设计者和论文的修改人。全体作者都同意最终的文本。

致谢

本研究由国家自然科学基金(31971907)和高等学校学科创新引智计划(111项目, B14016)共同资助。

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